Régulation de la transcription de gènes par la méthode CRISPR-Cas9

Objectifs

À l’issue de l’atelier en biotechnologies, vous aurez acquis les connaissances nécessaires pour :

  • comprendre le fonctionnement général du système CRISPR-CAS9 comme outil de ciblage moléculaire de génomes ;
  • procéder au design de séquences de ciblage gARN et à leur insertion dans des systèmes d’expression adéquats pour une culture cellulaire mammifère ;
  • exprimer les éléments requis du système CRISPR-CAS9 pour les applications visant à moduler la transcription de gènes ;
  • valider l’efficacité du ciblage d’un gène d’intérêt et déterminer les approches d’optimisation si nécessaire.

PUBLIC

Salariés ou demandeurs d’emploi souhaitant s’orienter vers une carrière de chercheur, ingénieur ou technicien actif en laboratoire de recherche, qu’il soit académique ou privé

PRÉ-REQUIS

  • Bonne culture générale en biologie
  • Connaissances de bases en biologie moléculaire (structure de l’ADN, ARN, principe de la PCR, de la qPCR, clonage, etc.)
  • Connaissances de bases en biologie cellulaire (notamment principes de la culture de cellules eucaryotes, transfection)

Contenus

  • La technologie CRISPR-Cas9 est un outil de biologie moléculaire dérivé du système d’immunité inné de certaines bactéries pour combattre les attaques de virus bactériens tels que les bactériophages.
  • Mise en pratique de cette approche appliquée à l’inhibition et l’activation de l’expression d’enzymes permettant de phosphoryler ou déphosphoryler d’autres protéines, un événement moléculaire très courant dans des processus physiologiques finement régulés.
  • Les participants à cet atelier réaliseront les différentes étapes suivantes :
    • design de séquences CRISPR, dites « guides » ARN pour modifier la transcription de phosphatases tels que PPP1CA ou apparentées ;
    • clonage de séquences gARN dans un vecteur d’expression ;
    • expression des gARN et Cas9 modifiés pour activer ou inhiber la transcription en culture cellulaire eucaryote (HEK293T) ;
      vérification de la modification de l’expression du gène ciblé par western blot ;
    • analyse des résultats et quantification.

Modalités pédagogiques

Atelier intégré au groupe de formation initiale du master 2 Biotechnologies – parcours Ingénierie cellulaire et moléculaire ou possibilité de groupes spécifiques entreprises

  • Encadrement effectué par un des responsables pédagogiques
  • L’atelier se focalise sur le travail pratique sur des cas de figures concrets, avec explications théoriques à des moments clefs de l’atelier.

  • Le travail est effectué individuellement et en groupe, principalement binômes ou trinômes, en fonction des tâches.

  • Chaque participant fera une présentation orale d’un article utilisant l’outil CRISPR/Cas9 dans un contexte différent de celui de l’atelier

  • Chaque participant rédigera un compte-rendu individuel à rendre à la fin de l’atelier.

  • L’évaluation se fera sur le travail de présentation, de rédaction du rapport et de travail pratique.

Matériels utilisés

  • Culture de cellules eucaryotes : PSM, incubateurs, bains-marie, centrifugeuses…
  • Clonage : kits d’extractions d’ADN, purification des AN, spectrophotomètres, cultures de bactéries compétences…
  • Matériel de transfection de cellules
  • Appareils à PCR